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 Western blot

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Tiffany
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MessageSujet: Western blot   Lun 30 Juin 2008 - 15:43

Ici j'ai juste copier un lien car il est tres bien explique en plus avec des images



Western Blot :


Que signifie cette expression ? C'est un M. SOUTHERN qui a mis au point le Southern blot, test pour l'ADN. Western n'est ici qu'un jeu de mot par rapport à Southern. Quant à blot, ce mot vient de l'anglais blotter (buvard) et signifie empreinte (obtenue par aspiration capillaire). En effet, une phase du Western blot consiste à faire passer les protéines d'un premier gel qui a servi à les séparer, dans une membrane en nitrocellulose - voir ci-dessous.

PRINCIPE : Le Western blot est un test de laboratoire qui permet de rechercher dans le sérum sanguin des protéines antigéniques et en particulier des protéines virales avant que les anticorps ne soient apparus, mais aussi, dans un délai égal ou supérieur à 4 semaines suivant la contamination, des anticorps dirigés contre ces protéines (il faut en effet environ 4 semaines pour que l'on trouve les premières traces d'anticorps dans le sang des malades).


Il sert également de confirmation lorsque le test ELISA est positif, même partiellement. Dans ce cas, ce sont les anticorps anti-VIH produits par le patient qui sont recherchés.


1ère étape : Les protéines (antigènes) présentes dans le sérum du patient sont séparées sur un gel SDS-PAGE (Sodium Dodécylsulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) par électrophorèse, c'est-à-dire que le gel est placé dans un champ électrique. On procède d'abord à une concentration, puis à une séparation des protéines. Celles-ci étant rendues électronégatives par le SDS se sépareront en fonction de leur masse molaire et non pas en fonction de leur charge électrique, d'autant plus loin de la ligne de départ que leur masse molaire est faible.



2ème étape : C'est le blot, qui va faire passer les protéines antigènes séparées, du SDS-PAGE vers une membrane de nitrocellulose, plus intéressante pour la mise en évidence des protéines virales recherchées.



3ème étape : Des anticorps fabriqués en laboratoire, spécifiques des protéines recherchées, auxquels on a préalablement accroché des enzymes ou des radiomarqueurs, sont déposés sur la membrane de nitrocellulose par arrosage ou immersion. Ils se fixent sur les protéines dont ils sont spécifiques, puis on procède à un rinçage pour éliminer les anticorps qui ne se sont pas fixés. On recommence la même opération avec des anticorps marqués (auxquels on a accroché une enzyme facile à mettre en évidence) qui vont se fixer, s'ils existent, aux premiers anticorps. Puis on les met en évidence par coloration enzymatique ou autoradiographie. Le test est négatif si on n'observe rien, c'est-à-dire s'il n'y avait aucune protéine du VIH dans le sérum du patient.



* La positivité du Western blot est certaine en cas de réactivité simultanée vis à vis de 2 anticorps anti env (gp160 et gp120) et d'1 anticorps anti gag ou 1 anticorps anti pol. Un second prélèvement est toutefois demandé et contrôlé pour s'assurer qu'il n'y ait pas eu d'erreur de prélèvement ou de contamination du premier échantillon.
* La positivité du Western blot est probable en cas de réactivité vis à vis des anticorps anti-p24 et des anticorps anti-gp160 ou en cas de réactivité vis à vis uniquement d'anticorps anti-env (gp160 et gp120)




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MessageSujet: Re: Western blot   Lun 30 Juin 2008 - 16:15

Super toutes ces informations (bon, comprends pas tout, hormis l'étape de l'électrophérèse...) : c'est ce que tu fais dans ton labo, toutes ces manipulations, car c'est vraiment complexe ! suppose que vous devez avoir de sacrés protocoles à observer à la lettre !!!
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Tiffany
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MessageSujet: Re: Western blot   Lun 30 Juin 2008 - 17:45

oui moi j'en ai fasi avant..maintenant je fais d'autres analyse...le truc c'ets que vu qu'on est dans le domaine pharmaceutique il faut respecter beaucoup de lois..donc j'ai des protocoles enormes ou chaque partie je dosi signe et dater...a la fin de la journee je crois qeu je signe 800 fois lol!
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MessageSujet: Re: Western blot   Lun 30 Juin 2008 - 17:48

Heureusement que tu fais pas payer l'autographe lol!
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MessageSujet: Re: Western blot   Lun 30 Juin 2008 - 17:48

cheers

MERCI.
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MessageSujet: Re: Western blot   Lun 30 Juin 2008 - 17:57

Sylviuche a écrit:
Heureusement que tu fais pas payer l'autographe lol!

lol! oui effectivement

parfois j'ai l'impression d'etre une star afro
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